Domanda:
Come posso migliorare la resa delle corse di sequenziamento MinION?
gringer
2017-05-31 14:48:19 UTC
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Questa è una domanda frequente nella comunità dei nanopori. Oxford Nanopore attualmente afferma di essere in grado di generare rendimenti di 10-15 gigabase (ad esempio, vedere qui e qui), e tuttavia è più comune vedere gli utenti che gestiscono solo in l'intervallo 1-5 gigabase.

Allora perché la grande differenza di rendimento?

Tre risposte:
#1
+12
gringer
2017-05-31 15:02:35 UTC
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Ho partecipato a un discorso di Josh Quick al PoreCampAU 2017, in cui ha discusso alcuni ostacoli comuni per ottenere sia una buona resa di sequenziamento che una lunga durata di lettura. Principalmente si riduce a essere più attenti con la preparazione del campione. Tieni presente che il MinION sequenzierà ancora un campione sporco, avrà solo una resa ridotta. Ecco i miei appunti da quel discorso:

  • La cosa più difficile del sequenziamento di MinION è innanzitutto ottenere il campione
  • Ci sono molti diversi tipi di campioni e metodi di estrazione
  • Non puoi ottenere letture più lunghe di quelle che hai inserito; la merda dentro porta alla merda fuori
  • Il DNA è molto stabile quando non si muove, ma molto sensibile ai danni laterali
  • Il metodo di estrazione del DNA con fenolo cloroformio è molto buono e può essere usato con un gel ad aggancio di fase per rendere più facile l'estrazione
  • Una semplice estrazione di sale + alcool potrebbe essere il metodo migliore per l'estrazione (perché richiede la minima quantità di lavoro sul DNA)
  • EDTA (ad esempio, come si trova nel buffer TE e in molti kit di estrazione) non è compatibile con il kit rapido
  • Le corse Nanopore più costantemente buone prodotte dal laboratorio di Josh erano le corse di ligazioni 1D su R9.4; la migliore esecuzione complessiva è stata un'estrazione con fenolo-cloroformio + kit rapido
  • John Tyson può sintonizzarsi su un buco a basso rendimento (tramite software)
  • Ottenere un piccolo numero di letture brevi è molto importante
  • Tecniche di purificazione suggerite (e per lo più non testate): spin column (60-100kb); estrazione di etanolo (100-150kb), dialisi (150-250kb); tappo di agarosio a basso punto di fusione (~ 1 Mb, estrazione del DNA in situ)
  • L'input del protocollo nanopore è in nanogrammi, ma dovrebbe essere dichiarato come molarità; il kit prevede un input di circa 0,2 pmol
  • Picture molecole legate alla superficie della membrana. È quindi possibile vedere che la densità della cella a flusso è indipendente dalla lunghezza della sequenza
  • Tapestation, Qubit e Nanodrop sono tutte una buona idea; un campione di DNA che può superare tutti e tre i test funzionerà bene: nessuna spalla corta con Tapestation, DNA sufficiente con Qubit, elevata purezza con Nanodrop
  • L'RNA può interferire con il sequenziamento; si consiglia di digerire l'RNA
  • Il congelamento del DNA è una pessima idea. I cristalli di ghiaccio sono molto bravi a sminuzzare il DNA in piccoli pezzi
  • Il DNA che viene tenuto in frigorifero è notevolmente stabile; può essere conservato per oltre due anni (e probabilmente a tempo indeterminato)

Aggiornamento sulla resa:

Abbiamo avuto una corsa nel giugno 2018 che ha prodotto circa 3 milioni di letture da PCR- cDNA di topo amplificato (leggi N50 di ~ 1kb), ed era in una situazione in cui era il primo campione preparato da qualcuno, la quantità di DNA in ingresso era probabilmente circa il 20% di quello che avrebbe dovuto essere, e abbiamo subito un incidente di perdita di dati . Se questo è quello che è successo con una cattiva corsa, ho grandi speranze per le nostre analisi in futuro.

La nostra prossima analisi del cDNA nell'agosto 2018 ha prodotto circa 7 milioni di letture e una lettura simile N50 (cioè resa totale di circa 7 GB). La corsa è stata interrotta da un aggiornamento di Windows durante la prima notte (avevo disabilitato gli aggiornamenti automatici in precedenza, ma erano stati riabilitati) e da allora sono stati apportati ulteriori aggiornamenti software e hardware per migliorare la resa del sequencing. Se disponiamo di una buona cella a flusso e di una preparazione del campione simile, mi aspetto che il prossimo ciclo di cDNA che faremo dovrebbe produrre oltre 8 milioni di letture e forse oltre 10 milioni.

#2
+2
roblanf
2017-06-10 08:52:26 UTC
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La mia scommessa è che la gente dei nanopori abbia (ovviamente!) fatto un sacco di ottimizzazione su due cose fondamentali:

  1. The DNA cleanup
  2. The library preps

Penso che per la maggior parte delle estrazioni di DNA le pulizie possano variare molto, ma qualcosa come un Blue Pippin farà un lavoro eccezionale se hai accesso a uno e puoi usarlo (non funzioneranno per frammenti di DNA SUPER lunghi che non possono muoversi attraverso un gel ovviamente). Il Blue Pippin fa anche la tua selezione delle dimensioni, quindi non bruci i pori sequenziando molte piccole cose. Anche questo dovrebbe aiutare a produrre.

Quindi dipende tutto dalla preparazione della libreria, e la risposta di @gringer ha alcuni buoni suggerimenti su questo.

#3
+1
Saidi Rahina Hussain
2018-10-27 01:28:34 UTC
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Sto lavorando con un fungo e sto usando il metodo CTAB per l'estrazione del DNA e ho usato il kit rapido per la mia preparazione iniziale della libreria ma non ha funzionato e da allora utilizzo il kit di legatura e mi ha dato ottimi risultati . Sono riuscito a ottenere dati compresi tra 4 GB e 13 GB.



Questa domanda e risposta è stata tradotta automaticamente dalla lingua inglese. Il contenuto originale è disponibile su stackexchange, che ringraziamo per la licenza cc by-sa 3.0 con cui è distribuito.
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